全新anti-CRISPR蛋白 抑制基因编辑“魔剪”分子Cas3的分子机制研究

  • 博士生组 票数:698
  • 姓       名:王小飞
  • 导       师:朱永群
  • 成果类别:论文著作类
  • 院系(学园):生命科学研究院
团队介绍

        浙江大学生命科学研究院的朱永群课题组致力研究病原微生物与宿主相互作用的分子机制,团队已在细菌与宿主相互作用领域做出了多项具有原创性和开拓性的研究工作,相关的研究成果以通讯/共同通讯作者发表在Cell、Nature Structural & Molecular Biology、PLoS Pathogens、JBC、Cellular Microbi-ology等国际著名学术期刊上。

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科研心得

这个项目从实验设计到杂志接收用了大约半年时间,虽然速度还可以,但过程并不是一帆风顺的。春节过后没有花很多时间陪家人便冲回实验室推进课题,当时正值噬菌体肆虐,一个多月都无法纯化出蛋白,后来纯化出来蛋白了晶体优化却出了问题,晶体总是长在沉淀中且长得很小,只能从众多晶体中仔细挑取质量看似较好的一些,并且在朱永群老师的指导下尝试各种晶体防冻液,用液氮冻存了32颗较好的晶体拿到上海光源同步辐射中心去收取X射线衍射数据,最终只有一颗晶体数据的质量足够好。解结构很是神奇,老师们都认为需要至少一周的时间,而我在先进软件的帮助下连夜就得到了初步的结构。还有生化实验,每一个小实验都要严谨求实,精益求精,直到结果足够可靠且漂亮。

        论文发表后得知国内外好几个实验室都在做这个课题,而我们是最先做出来的。研究成果也得到了同行的关注和高度评价,该项目研究成果于2016725日在线发表在国际著名期刊Nature Structural & Molecular Biology上,于20169月期刊正式刊登。Nature Structural & Molecular Biology在同期期刊上发表了发表题为“A molecular arms race: new insights into anti-CRISPR mechanisms(分子间的军备竞赛: CRISPR对抗机制的新视角)”的专文特别报道,高度评论这一研究成果。Science杂志于99日以Editors Choice方式发表了题为“Bacteriophage fights back(噬菌体反击了)”专文对这项工作进行了特别关注和重点评述。

        研究成果得到好评和引用,让我很是欣慰,让我觉得身为浙大学子,我为社会做了一点贡献了;也让我充满感恩之情,感谢朱永群老师的指导,感谢各位同行的帮助,以及家人朋友的支持和关爱。

成果简介

对手臣服,收“剪”入鞘


        CRISPR-Cas系统是一种高效且方便的基因编辑工具,是当前生物领域非常前沿的研究领域之一,可以从根本上治愈镰状细胞性贫血等各类遗传病,该系统的效应酶分子Cas9和Cas3等被誉为神奇的“魔剪”分子,但其持续的活性在生物医疗等方面存在严重的安全问题。如何在时间和空间上有效地和选择性地抑制这些魔剪分子是当前一个重要科学问题。目前已经发现来源噬菌体AcrF3蛋白能够有效抑制I-FCRISPR-Cas系统效应酶分子Cas3,但具体作用机制完全不清楚。

朱永群课题组首次表达纯化了来源于绿脓杆菌的Cas3效应分子(简称PaCas3)与其anti-CRISPR蛋白AcrF3的复合物,通过生化研究发现AcrF3以同源二聚体的方式作用于PaCas3,同时揭示了PaCas3是一个二价金属离子依赖的核酸酶。然后通过解析PaCas3-AcrF3复合物2.6埃高分辨率的晶体结构,发现PaCas3的一个全新结构特点,其N端具有一个独立Cas2结构域,导致PaCas3具有既参与了DNA适应又参与了DNA干扰的双功能活性。进一步研究发现,AcrF3先以反向对称的方式形成同源二聚体,与PaCas3广泛且紧密结合。AcrF3二聚体将PaCas3锁定在ADP结合的失活状态,并且完全屏蔽了PaCas3DNA结合通道的入口以及上游信号分子Cascade的识别,从而将有效地抑制的PaCas3的核酸酶活性。

        在国际上首次揭示全新anti-CRISPR蛋白抑制基因编辑工具中的“魔剪”分子(即CRISPR-Cas免疫系统效应酶分子)的功能机制,首次报道了CRISPR-Cas免疫系统效应酶分子与anti-CRISPR蛋白复合物的高分辨率三维结构,首次向人们展示了I-F型CRISPR-Cas系统效应酶分子的全新生化机制和结构特点,不仅向人们展示了细菌与噬菌体之间的长期相互斗争和生物共进化过程中的精彩生物学现象,而且为人们安全应用CRISPR-Cas基因编辑系统提供了重要启示。

项目成果